MUESTRA BIOLÓGICA
Para obtener una imagen de una muestra biológica con SEM, la muestra necesita una superficie conductora y debe colocarse dentro de un alto vacío; debido a la naturaleza intrínseca de las interacciones de electrones y materia que son responsables de la formación de imágenes. Por lo tanto, los especímenes biológicos no se pueden visualizar en su estado original y deben procesarse intensamente. Por ello, la preparación de la muestra es un paso crucial.
Fijación primaria con aldehídos (proteínas)
Las proteínas se entrecruzan con glutaraldehído y formaldehído para estabilizar la ultraestructura antes del procesamiento posterior.
fijación secundaria con tetróxido de osmio (lípidos)
Las membranas lipídicas se fijan para evitar su extracción por solventes durante la deshidratación. El precipitado de osmio negro que se forma durante este proceso aumenta la conductividad de la muestra y minimiza las distorsiones de imagen resultantes de la carga.
Serie de deshidratación con solvente (etanol o acetona)
Una muestra fijada se deshidrata mediante incubación en una serie de soluciones de etanol o acetona. La concentración de solvente se aumenta gradualmente para que el agua se elimine suavemente, sin causar la contracción de la muestra.
secado
Permitir que la acetona o el etanol simplemente se evaporen de la superficie de la muestra crearía microdesgarros en la superficie al salir, ya que estos solventes tienen una tensión superficial relativamente alta. para evitar esto, los solventes de deshidratación se reemplazan con hexametildisilazano (HMDS) o CO2 líquido. HMDS se puede utilizar en preparaciones de células y después de una incubación corta (3 minutos) se elimina y el exceso se deja evaporar. El CO2 líquido, por otro lado, se aplica a los tejidos en un secador de punto crítico donde se lleva a una temperatura y un punto de presión críticos en los que se vaporiza
montaje en un trozo
La muestra se monta en un trozo de metal usando un disco de carbono pegajoso que aumenta la conductividad. además, se puede aplicar pegamento que contiene plata para obtener aún más conductividad.
Recubrimiento por pulverización catódica con material conductor
Para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra, se recubre con un material conductor, generalmente oro. El metal se aplica de forma controlada en un dispositivo de pulverización catódica. Es fundamental que el recubrimiento sea lo suficientemente grueso para evitar la carga (normalmente alrededor de 10 nm) pero no lo suficientemente grueso como para oscurecer los detalles de la superficie de la muestra.
Para algunas aplicaciones avanzadas, tendrá que aplicar la crío-fractura y posiblemente crío-grabar las muestras.
Observación de muestras criofijadas
El microscopio electrónico de barrido (SEM) puede dotarse de un sistema capaz de observar la muestra a muy baja temperatura de forma que su preservación estructural es máxima y la capacidad de trabajo del microscopio no se afecta en absoluto, pues ya no tratamos con una muestra hidratada sino congelada.
El proceso se inicia fuera del microscopio, enfriando la muestra a la máxima velocidad posible mediante nitrógeno nieve. A continuación ya pasa al sistema de crio-observación, donde se puede fracturar, sublimar el hielo superficial y recubrir con oro o carbono para su observación y/o análisis.
La ventaja de este sistema es que se puede observar cualquier muestra biológica o hidratada con una preparación mínima y rápida con una buena preservación estructural.
¿Para qué aplicaciones se utiliza la crío-fractura?
Para revelar las estructuras finas internas de una muestra biológica u orgánica.
Generalmente, la crío-fractura se utiliza para aplicaciones biológicas, como la investigación de estructuras subcelulares, por ejemplo, orgánulos y membranas. Sin embargo, más recientemente la técnica se ha vuelto interesante para ciertas aplicaciones en la ciencia de los materiales y la física en relación con las capas y emulsiones.